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万新医药生物部首席专家方宏清:多肽生物合成


发布时间:2018-12-31 药融圈


药融圈第149场专享会
宾:方宏清万新医药生物部首席专家 
 

方宏清,微生物制药专业博士。本科1986年毕业于华东化工学院生物化学工程专业(现华东理工大学)。原军事医学科学院生物工程研究所合成生物学研究室副主任,课题组长。主要从事基因工程药物、代谢工程及合成生物学研究。曾获国家科技进步二等奖1项,国家新药证书1项,并成功转让给上海联合赛尔公司。2016年自主择业。曾在齐鲁制药(内蒙古)有限公司工作,任副总经理、药物研究院院长等职。现在万新医药科技(苏州)有限公司工作,任生物部门首席专家。曾参加的项目有亚单位疫苗研发,重组多肽药物研制,青蒿素前体的生物合成,大肠杆菌基因组改造,抗生素生产菌种链霉菌改造等。

今天主题是多肽的生物合成,分3个部分介绍。

 

一、多肽的概念 

二、多肽的制备方法。 

三、实例介绍:N-乙酰化胸腺素β4的生物合成。

 

多肽是由氨基酸通过肽键连接形成的聚合物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等等。通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽);10~50个氨基酸组成的肽称为多肽;由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。蛋白质有时也被称为多肽。

 

多肽制备方法

​​多肽制备方法有三种:

1、发酵或酶法降解蛋白质;

2、化学合成方法;

3、生物合成(基因工程、重组技术)方法。

•1953,第一个化学合成多肽药物催产素,由9个氨基酸组成。 

•1974,第一生物合成多肽药物胰岛素,由51个氨基酸残基组成。 

•当氨基酸残基数较多(~30aa以上)时,基本采用生物合成方法。 

•生物合成的优点是大规模生产时成本低、环境相对友好。缺点是难以实现非天然氨基酸掺入及其它修饰。

•生物合成蛋白质或多肽,多数采用哺乳动物细胞表达系统和微生物表达系统(大肠杆菌、酵母等)。哺乳动物细胞表达系统可以实现糖基化修饰等,单成本高;微生物表达系统产量高、成本低。​

 

多肽的基因工程制备方法

​​

一、表达策略 

分泌表达:将小肽分泌到细胞周质或培养基中以避免被细胞内蛋白酶降解。

融合表达或串联体表达:需要切割步骤释放单体肽。

二、切割与修饰

切割方法:包括化学切割、酶法切割和Intein介导的切割。 

特殊修饰:与相关酶基因共表达。

分泌表达:

•可采用酵母表达系统、大肠杆菌表达系统等。

•与胞内表达相比,重组蛋白分泌到胞周质或胞外培养基显示出了许多优势

 

具体表现如下:

1)利用大肠杆菌系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间。经信号肽酶将信号肽切除后,即可获得与天然蛋白一致的结构(不含N 端多余的甲硫氨酸)。

2)大肠杆菌的周质空间和胞外培养基中的蛋白酶活性要比胞质中低,多肽分泌到周质中能避免被胞内蛋白酶降解。

3)由于周质中杂蛋白较少,重组蛋白更容易纯化。

4)细胞周质提供的氧化环境有利于二硫键的正确形成。

 

大肠杆菌中分泌表达常用信号肽,信号肽名称,氨基酸残基序列​

 

 

利用大肠杆菌碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽成功地将胸腺素α1分泌至培养基中,分泌表达量达到每升500毫克,经分离纯化,得到N端非乙酰化的重组胸腺素α1。 

利用ompF 信号肽将人b-内啡肽分泌到培养基中。 

α因子信号肽,酵母分泌表达GLP-1类似物。

分泌表达采用酵母的较多,大肠杆菌难度大。

大肠杆菌分泌表达做的好是国外一家公司,能达到10g/L左右。我在安徽大学任讲席教授期间,做过一段时间大肠杆菌分泌表达系统研究,表达抗体Fab片段,通过多种基因改造,包括大片段删除,表达水平在摇瓶中可以达到近100mg/L(分泌到培养基中) 

融合表达

融合表达:十个氨基酸组成的多肽,通常难以在胞内直接表达。常采用和其他多肽序列融合表达的方式。

 

融合载体的选择:分子量小、高表达、易切割

Trx或GST:可溶表达,Trx (12kDa),GST(26kDa)

PurF:形成包涵体 ,适用于不含二硫键的多肽表达,常用羟胺切割   SUMO:可溶11kDa

Intein:可溶或包涵体。选择合适的融合载体后,就要考虑切割释放目的肽段问题了。

 

融合蛋白切割可分为三类: 

1、化学切割 

2、特异性酶切割 

3、自我切割:FrpC 、 Sortase A 、Intein(内含肽) 

常用化学切割方法:

溴化氢:切割Met-X之间的肽键,释放肽键C端的完整肽端;

羟胺:特异性切割Asn-Gly肽键;

稀酸:水解Asp-Pro肽键;

CDAP:则诱导X-Cys肽键的断裂。

缺点:有较多的副产物

 

化学切割的文献案例 

将抗菌肽indolicidin的串联体与硫氧还蛋白融合表达,表达产物经溴化氢切割得到活性单体。 

用羟胺切割抗菌肽halocidin融合蛋白,获得分子量约2kDa的十八肽。 

用甲酸切割融合蛋白获得抗菌肽LL-37。 

用CDAP切割获得PTH 1-34。 

 

常用特异性切割蛋白酶

肠激酶:D-D-D-D-K-↓-X (X为除Pro以外的残基)

Factor Xa:I-E/D-G-R-↓-X (X为除Arg和Pro以外的残基)

Thrombin:L-V-P-R-↓-G-S,L-V-P-R-↓-G-F,M-Y-P-R-↓-G-N

TEV:E-X-X-Y-X-Q-↓-S                                                                                     

最佳切割序列为E-N-L-Y-F-Q-↓-S

Furin:R-X-K/R-R-↓-X

HRV 3C Protease:LeuGluValLeuPheGln ↓ GlyPro 

天冬酰胺内肽酶:-Asn-↓-Gly-

SUMO蛋白酶:识别特定的结构域
 

 

SUMO蛋白酶的特点 

识别SUMO的空间结构,不是一级序列,非常稳定,能耐受,2M尿素、0.1M、盐酸胍0.15M NaCl、0.3M咪唑、1%Triton X-100、20mM DTT或2-ME、20mM GSH

特异性蛋白酶切割的文献案例:

用肠激酶切割硫氧还蛋白融合蛋白获得由33个氨基酸残基组成的抗菌肽adenoregulin。 

用肠激酶切割重组融合蛋白获得39个残基组成的GLP-1受体的长效激动剂exendin-4。 

用凝血酶切割GST融合蛋白获得由牛乳铁蛋白衍生的25个氨基酸残基组成的抗菌肽LfcinB。 

用泛素水解酶切割泛素融合蛋白,每升可以得到15mg抗菌肽。 

用Furin蛋白酶切割抗菌肽串联体,每升获得了167mg的抗菌肽histonin。 

用亮氨酸氨肽酶切割(HHL)40串联体,每升获得了6.2mg的抗高血压三肽HHL。

 

自我切割技术 

FrpC (from Neisseria meningitidis )  当加入钙离子后,FrpC能在Asp和Pro之间发生自我切割。体外切割反应十分迅速,6h后几乎100%切割。缺点是切割后,目的蛋白C端会产生多余氨基酸残基Asp。

 

Sortase A转肽酶(from Staphylococcus aureus):将SrtAc的催化中心与其识别序列LPETG融合便形成了自我切割模型。当加入5mM Ca2+和5mM GGG后,识别序列LPETG的 Thr-Gly键发生切割。通常25℃反应4-6h可以完成切割反应产生目的蛋白。切割后目的蛋白N末端会留下多余的Gly残基。 

 

 

Intein(Internal proteins):内含肽,是一种蛋白剪接元件,它可以介导自身从蛋白前体中切除,同时将两侧蛋白-exteins (External proteins)进行相连,形成全长的外显肽。 它是一个翻译后自催化加工过程,它不需要酶或其他辅助因子的参与。Intein在空间上分为三个区域,即N端结构域,C端结构域和中间的归巢内切酶结构域(微型Intein中不存在)。N端和C端结构域形成Hint结构域,在该结构域催化下Intein介导蛋白发生剪接。

 

nteins的结构特征

(a) 经典Intein;(b) 微型Intein 

 

Intein介导的蛋白质剪接是一个自催化加工过程。

 

 

 

前面提到的Intein都是来自一个前体蛋白,其自切割方式称为顺式剪接(cis-splicing)。此外,许多生物体中还存在反式剪接(trans-splicing)的Intein(也称为split intein),可以将两个不同基因编码的蛋白连接。

 

将Intein的N末端或者C末端氨基酸残基突变,可以阻断剪接过程,但不影响其C端或者端切割功能。这些Intein可以分为两类:一种为改变pH诱导发生C端切割的Intein,另一种是用巯基试剂诱导N端或者C端切割的Intein。

 

Intein的N端诱导切割:将Intein的C末端Asn残基突变为Ala可以阻断剪接和C端肽键断裂,但不阻断N-S/O酰基重排介导的N端肽键断裂。

 

 

 

 

Intein的C端诱导切割 

​​

将Intein的N末端Cys残基突变为Ala,将目的蛋白融合在Intein的C端则可以通过改变pH的方式来诱导自切割,避免使用巯基试剂诱导切割,会破坏一些富含二硫键的分子结构。

 

pH诱导型Intein最大的缺点是胞内表达过程中,融合蛋白自我切割去除亲和标签的现象比较严重,这就导致目的蛋白胞内损失严重,得率较低。巯基试剂诱导型Intein介导融合体内表达时体内自切割较少,因此通常目的蛋白得率较高。 

 

蛋白质的翻译后修饰: 

乙酰化

磷酸化

硫酸化

脂酰基化

糖基化

 

重组表达实现修饰方法: 

拓展遗传密码:如,Tyr的硫酸化与细胞之间通讯、病毒入侵等有关。将TAG改造为编码sulfotyrosine 的密码子,可以在大肠杆菌内表达位点特异性硫酸化蛋白。

 

重组表达实现修饰方法: 

拓展遗传密码:如,Tyr的硫酸化与细胞之间通讯、病毒入侵等有关。将TAG改造为编码sulfotyrosine 的密码子,可以在大肠杆菌内表达位点特异性硫酸化蛋白。

 

与酶基因共表达: 如,肉豆蔻酰转移酶、乙酰转移酶、蛋白激酶(磷酸化)、羟化酶、糖基转移酶

 

 

 

 

胸腺素β4的生物合成
 

胸腺素β4是具有N端乙酰化修饰的43肽。一级结构和二级结构 

 

临床应用 

滴眼剂 ——正在进行中重度干眼症治疗的临床研究

注射剂 ——正在进行急性心肌脑损伤的临床研究

凝胶剂 ——正在进行治疗大疱性表皮松解症的临床研究  

 

胸腺素β4生物合成策略思考: 

目前在临床研究的样品是采用化学合成的。生物合成存在两个问题:N端乙酰化修饰、小分子肽表达困难。 

如何实现N端乙酰化修饰呢?找到合适的酶。胸腺素β4在大肠杆菌中表达时是没有乙酰化修饰的, 因为没有对应的乙酰转移酶存在。所以第一步要找到该酶。 

真核细胞中的乙酰转移酶底物虽广,但结构比较复杂,难以在大肠杆菌中表达。

古生菌在进化上介于细菌和真核生物之间,其乙酰转移酶结构简单,底物范围也较细菌的广。 

我们在古生菌中找到一个合适乙酰转移酶。 

 

古生菌——细菌与真核生物之间的桥梁。

 

首先在体外反应体系中进行酶的特异性筛选:古生菌的乙酰转移酶具有更广的底物,可以对胸腺素β4进行乙酰化修饰

利用基因编辑方法构建可N-乙酰化修饰多肽大肠杆菌:

在找到所需要酶后,进行表达设计。表达策略上,将胸腺素β4置于融合蛋白的N末端, 下面就要选择合适切割方法了。根据结构特点,我们选择Intein进行融合表达。

重组人N-乙酰化胸腺素β4的表达及纯化 

在大肠杆菌中实现了高表达,经过切割纯化获得目标多肽,质谱测定分子量与理论值一致,序列分析也证明确实是乙酰化的,这个多肽没有二硫键,二硫键的多肽通常采用酶切割技术,反相RP-HPLC Trypsin消化,捕获目的肽段,再串联质谱 ,可以采用疏水层析、离子交换、反相,串联质谱可以对肽段序列进行分析,确定乙酰化修饰位点 ,每升能获得200mg以上纯品 ,若采用高密度发酵,产量可进一步提高。

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